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学术讲座
刘晓杰:细菌对消毒剂的抗性研究进展
 
超级细菌,即多重抗药性细菌的控制,已经受到广泛的关注。超级细菌感染,由于缺乏有效的抗菌药物治疗,成为一个世界性医学难题。近年来的研究发现,细菌不仅对体内抗菌药物产生抗药性,对以控制环境微生物为目的的消毒药物也产生了抗药性,有些细菌还对多种消毒剂有抗性,这是一个应该高度重视的问题。
1951
Lowbury观察到假单胞菌对季铵盐类化合物有耐受现象,提出了随着时间的推移,细菌对消毒剂的敏感性正在逐渐减低,1988年Chapman也报道了细菌对包括季铵盐、氯己定、戊二醛以及酚类化合物在内的几种杀生剂产生抗性。
随着对微生物抗生素耐药机制研究的深入,对消毒剂的抗性研究也在发展,主要的机制是微生物的通透性屏障Denyer SP 2002),其他机制如细胞外膜孔道蛋白的改变(Dé E等2001),主动外排机制(Heinzel M 1998),由基因改变而引起作用靶位的变化,如Fab I基因突变产生酰基载体蛋白还原酶enoyl reductase),造成对三氯羟基二苯醚产生抗性(McMurry LM 1998)等等。
一、细菌对消毒剂抗药的情况
消毒剂在医院感染控制中的作用极其重要,随着各种消毒剂的广泛使用, 细菌对消毒剂的耐药现象也已经成为预防医学领域一个新的独立课题。但是,对于消毒剂的使用尚处于粗放的管理模式,消毒剂的不合理使用不仅对环境生态系统造成破坏,更重要的是使微生物产生抗药性。
1.不动杆菌属:
徐燕等(2008)报道了7株临床分离的鲍曼不动杆菌中,4株携带qacE△1 - sul I 基因,抗药基因阳性的菌株对醋酸氯己定和苯扎溴铵的MIC值、MBC值明显高于大肠杆菌标准株,显示出这种基因携带与消毒剂抗力之间存在相关性。
2.假单胞菌属:
铜绿假单胞菌:徐燕等(2007采用PCR方法和肉汤稀释法分别检测临床分离铜绿假单胞菌qacEAl一Sul I基因和对消毒剂抗性变化,并与铜绿假单胞菌标准菌株进行了平行比较。临床分离的6株铜绿假单胞菌中,有5株检出qacEAl一SuI I基因阳性,抗药基因携带率达到83%以上,该抗药基因的携带与其对消毒剂的抗性有一定的相关性。
陆烨等(2008)报道了临床胃镜内分离的3株铜绿假单胞菌,其中一株对一种含氯消毒剂的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均为有效氯450 mg/L其余铜绿假单胞菌株均小于400 mg/L。对苯扎溴铵最小抑菌浓度为80 mg/L,最小杀菌浓度为156 mg/L对碘消毒剂的最小抑()菌浓度相同,均为1000 mg/L
王玉月等(2008)检测了临床标本中分离出铜绿假单胞菌190株菌对5种消毒剂的抗性,其中戊二醛和氯氧三嗪的抗性最强,MIC50分别为32μg/mL和64μg/mL;而对氯己定、苯扎溴铵的抗性最弱,MIC50分别为1μg/mL和2.4μg/mL
研究发现,Ⅰ型整合子是铜绿假单胞菌的重要耐药因子,林辉等(2009)采用PCR技术对临床分离26株铜绿假单胞菌进行型整合子检测携带型整合子16,61.5%。所有临床分离铜绿假单胞菌株对含碘消毒剂和苯扎氯铵两类消毒剂在常用浓度下均未产生抗性现象但有38.5%的菌株对含氯消毒剂的MIC和MBC值增加。对含氯消毒剂 MIC 和 MB C值增加的菌株中90%携带Ⅰ型整合子阳性。
荧光假单胞菌:被认为是一组通常定植于环境土壤、水、植物表面非致病性腐生菌。Samina Wasi等(2008年)通过对荧光假单胞菌SM1 株质粒介导的对几种主要的水污染物的耐受性研究证实:质粒产生了耐受性,SM1 株质粒研究显示出 43.6kb DNA 条带的存在。这种质粒从SM1中分离,以 6.7×10-4转化子/受体细胞的频率转化至 E.coli DH5a;试验 SM1 株具有转化 Cr(VI)为毒性较小的 Cr(III) 的能力。进一步的研究表明:试验SM1株不仅耐受2,4-D、苯酚、儿茶酚,而且对这些毒素还有有效的生物修复能力。此外,对一些抑菌剂如叠氮化钠、2,4-DNP(2,4-dinitrophenol)和氯霉素的研究显示:重金属的生物治理的主要机制绝不是Cr(VI)的生物吸附过程。
3.弧菌:
王贵明等(2009)报道了创伤弧菌ATCC 27562对常用消毒剂的抵抗力戊二醛的MIC 0.31g/L、MBC 为10.00 g/L过氧乙酸的MIC 为0.04 g/ L、MBC 为0.31 g/L,乙醇的MIC 为4.69%、MBC 为37.50%;20 g/L 戊二醛作用10s 杀灭创伤弧菌,5 g/L 过氧乙酸作用10 s 创伤弧菌被杀灭,75%(V/V)乙醇作用于创伤弧菌60 s将其有效杀灭创伤弧菌ATCC 27562对常用消毒剂抗性较弱常用浓度能将其迅速有效杀灭
4.金黄色葡萄球菌:
氯己定广泛应用于医院手卫生消毒,以防止包括 MRSA 在内的医院病原体的传播,然而病原微生物对氯己定敏感性的纵向监测数据却有限。Jann-Tay Wang等(2008)针对从台湾一家应用了20年葡萄糖酸氯己定的医院1990年、1995年、2000年、2005年收集的240株MRSA进行了氯己定敏感性、分子分型、序列分析及 qacA/B 基因分布等相关研究。结果显示:高氯己定 MIC(≥4mg/L)的 MRSA 共有85株,所占比例分别为:1990年1.7%1995年50%、2000 年40% 、2005年46.7% 呈现逐年上升趋势,其中55.4%携带 qacA/B基因。另外,首次从 MRSA 中检测到qacA/B基因是在1995年并且当时属于单克隆株,然而在2005年检测的 qacA/B 属于7个不同克隆株。
台湾Wang-Huei Sheng等(2009对从26家医院分离出的206株MRSA进行研究,MLST分型:102 (49.5%)株 ST239, 68 (33.0%) 株ST59, 13 (6.3%) 株ST5, 5 (2.4%)株 ST241,5 (2.4%)株 ST573, 13 (6.3%) 株其他型。所有菌株对氯己定的MIC50、MIC90分别为2μg/mL、8μg/mL,73 (35.4%) 株携带 qacA/B 基因,不携带 smr基因。72 (35.0%)株菌MIC 4 μg/mL。53株为 ST239 (49 株携带 qacA 基因), 12 株为 ST5 (全部携带 qacB 基因),5 株为 ST241 (4 株携带 qacA 基因), 1 株为ST338 (携带 qacA 基因),  1株为ST573 (携带 qacA 基因)。与其他MRSA分离株序列型相比,ST239 MRSA对氯己定及其他抗菌剂的抗性最强。携带消毒剂抗性基因qacA/B的MRSA在台湾普遍存在,特定序列型(ST239、ST5、 ST241)中高频率的qacA/B基因导致对氯己定的低敏感性。
姜新华等(2010)报道了临床上分离的20株 MRSA,对其中5株耐新洁尔灭的 MRSA qacA /B、smr、mecA 基因的检测和分析MIC≥100 mg/L4株 MRSA , qacA /B 基因除了第4株外,其他均能检测到, smr 基因仅在第4株中获得阳性结果,mecA 基因在第1和第4株中有阳性;而对于 MIC≥120 mg/L的1株 MRSA中, 3种基因 qacA /B、smr 和 mecA 均阳性。
张宏梅等(2010)收集医院公共消毒环境中分离的金黄色葡萄球菌共26, 采用最小抑菌浓度(MIC)方法对其抗药性进行检测,PCR扩增金黄色葡萄球菌中耐季铵盐消毒剂的 qacA/B, smr , qacG,qacH 和 qacEΔ1 基因结果26 株葡萄球菌中, 其中15MIC值大于标准菌株,均在45μg/mL以上其中9 株携带 qacA/B1 株携带smr ,qacG、qacH 和 qacEΔ1 均未检出
5.分枝杆菌:
林爱红等(2007)40mg/L的二氯异氰尿酸钠对脓肿分支杆菌医院感染株和分枝杆菌消毒标准株进行了悬液定量杀菌试验,结果40mg/L的二氯异氰尿酸钠作用1、5、10和20分钟对医院感染株的杀灭率与对消毒标准株的杀灭率比较无显著性差异。而此前的研究结果,该分支杆菌医院感染株对2强化中性戊二醛的抗性大于消毒标准株,这可能是因为该次研究的菌株长期接触低浓度的戊二醛诱导了抗性,但没有长期接触含氯消毒剂,未对含氯消毒剂产生抗性。随后的研究表明分支杆菌医院感染株与消毒标准株对2强化中性戊二醛的抗性差异与分支杆菌热休克蛋白(hsp65)基因无相关关系。
Hyeung-Jin Jang等(2009研究牛结核分枝杆菌 BCG 对2.5mM次氯酸钠的耐受性,揭示了牛结核分枝杆菌 BCG 的氧化应激应答基因(如氧化还原酶、过氧化物酶、热休克蛋白、新陈代谢基因)的重要调控作用。次氯酸钠作为一种氧化剂在初始阶段引起应激反应并导致热休克蛋白的表达;这一结果连同编码分枝菌酸生物合成基因的反向调节作用,阻止外层细胞壁的生物合成并导致氧化性损伤。
Zuzana Svetlíkova´等(2009)通过实验证实,细菌外膜孔道蛋白表达缺陷显著增加包皮垢分支杆菌、龟分枝杆菌对戊二醛、邻苯二甲醛的抗性,由于外膜孔道蛋白的缺陷,又显著增加了龟分枝杆菌对利福平、万古霉素、环丙沙星、克拉仙霉素、红霉素、利奈唑胺、四环素的抗性。因此,戊二醛、邻苯二甲醛在临床的广泛应用可能会产生选择性耐药细菌。
6.幽门螺杆菌:
幽门螺杆菌感染的病人进行内镜检查后常常会导致内镜被污染,戊二醛预洗和浸泡是内镜消毒的重要过程,然而并不一定能有效清除幽门螺杆菌,一些戊二醛抗性菌株可能存活并感染下一个病人。台湾Hung-Chuan Chiu等(2009在一临床菌株(NTUH-C1中鉴定出与戊二醛抗性相关的 Imp/OstA 蛋白,进一步的相关机制研究,imp/ostA msbA表达水平与临床分离菌株经戊二醛处理后产生的对戊二醛的抗性有关系,并且对低水溶性药物的抗药性产生发挥协同作用。
7.单核细胞增多性李斯特菌
Vicky G. Kastbjerg等(2010)将11种常用消毒剂按有效成份分为4组,研究他们对单核细胞增多性李斯特菌毒力基因(hly, plcA, prfA, and inlA表达的影响:相同有效成份的消毒剂对基因表达的影响相似,Northern blot分析确认 prfA inlA的表达被Incimaxx DES一种过氧化物消毒剂)反向调控,被Triquart Super(一种季铵盐)正向调控。
二、细菌对抗生素、消毒剂的交叉抗性
目前已知一些细菌对抗生素和消毒剂存在交叉抗性,如:对多粘菌素B与阳离子表面活性剂Denyer SP等 2002),对四环素类、喹诺酮类与季铵盐类化合物同时耐药(Levy SB 2002),耐多种抗生素的铜绿假单胞菌对三氯羟基二苯醚有抗性Chuanchuen R 2001)。关于抗生素-消毒剂交叉抗性产生的因果关系,是目前关注的问题。
Kimon A. G. Karatzas等(2008)将伤寒沙门菌鼠伤寒变种SL1344株连续7天暴露于农场常用的三种亚致死浓度的消毒剂,试图找出使用消毒剂与抗菌剂耐药的相关性。经过季铵盐分别与甲醛、戊二醛、焦油酸基础消毒剂(tar acid-based disinfectant)三种氧化复合物处理,获得稳定的变体OXCR1、QACFGR2、TOPR2。所有变体都显示出对环丙沙星、氯霉素、四环素、氨苄青霉素的敏感性有4倍降低,这与高性能液相色谱-质谱检测的所有菌株的外膜蛋白减少以及OXCR1、QACFGR2中高水平AcrAB-TolC相一致。OXCR1、 QACFGR2的蛋白图谱相似,但与TOPR2不同。这种不同的蛋白排列可防止受到氧化剂、硝基芳烃(nitroaromatics)、二硫化物、过氧化物作用而在所有菌株中被过度表达。与母本株相比,变体的生长和运动性减低,几种毒力蛋白的表达被改变,在肠上皮细胞扩散性降低。OXCR1、QACFGR2变体菌落形态为光滑型,显示出脂多糖O-抗原链长度分布改变,有助于产生短链O-抗原分子。同时检测到新陈代谢变化:蛋白合成增加,氧化磷酸化转化为底物水平磷酸化。提供了消毒剂能选择性的降低菌株对抗生素敏感性的实验证据。
为了研究细菌对抗生素耐药与对消毒剂抗性的相关性,R. Herruzo等(2009)用0.55% OPA,5%苯扎氯胺, 1%PVP-I, 1%氯己定, 对155株临床ICU分离的细菌(铜绿假单胞菌、肠杆菌科、其他细菌)同时进行了抗生素(阿米卡星、庆大霉素、托普霉素、头孢他啶、磷霉素、结肠霉素、羟氨苄青霉素、左氧氟沙星、磺胺甲基异恶唑-甲氧苄氨嘧啶)耐药性和消毒剂抗性实验。OPA的杀菌效果最好(杀灭对数值:铜绿假单胞菌5±0.6、肠杆菌科4.9±0.5、其他细菌4.4±0.8),与苯扎氯胺、氯己定无显著性差异,与PVP-I(杀灭对数值分别为2.6±0.6、3±0.7、 3.5±1.4,)有明显差异。只有5株细菌对所有抗生素都敏感,并且OPA对这5株细菌的平均杀灭对数值为5.2;对两种抗生素耐药的菌株,OPA的杀灭对数值为4.8;对两种以上抗生素耐药的菌株,OPA的杀灭对数值为4.7,但是其他三种消毒剂未见相似的结果。另外,不同的抗生素生物型细菌具有相似的杀菌效果,OPA、氯己定、苯扎氯胺杀灭对数值接近于5,PVP-I接近于3.5。然而,检测到3株对OPA具有高度抗性(杀灭对数值小于3)的细菌同时对磷霉素、托普霉素耐药。
为阐明杀生剂-抗生素抗性突变体的分子机制,Hideaki Maseda等(2009)用灵杆菌的高度交叉抗性CRes01菌株(对氯化十六烷吡啶、苯扎氯胺、葡萄糖酸氯己定、氟喹诺酮类、四环素、氯霉素耐药,对β-内酰胺类抗生素及N-dodecylpyridinium iodide敏感)进行分子水平研究,结果提示:暴露于氯化十六烷吡啶,通过SdeAB外排泵(efflux pump)基因表达该灵杆菌获得了杀生剂-抗生素交叉抗性。

 

 

参考文献 略
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