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学术讲座
薛广波,李华,陈荣凤:二溴海因消毒剂研究进展

      

由于二溴海因消毒效果可靠,且安全性和环保性好,近年来深受欢迎。我国卫生部已将二溴海因写入《消毒技术规范》(2002),凡可用含氯消毒剂消毒的消毒对象,均可使用二溴海因消毒。我国非典流行期间,许多媒体和指导性消毒读物将二溴海因推荐为防非典首选消毒剂。我国消毒行业协会发布的《公共场所消毒技术规范》(2010)和《医院消毒技术规范》(2008)也将二溴海因推荐为主要消毒剂。许多消毒学和医院感染学专家认为,二溴海因消毒剂最有可能继含氯消毒剂之后成为我国的主流消毒剂。
     1 概述
近年来,在寻找新型消毒剂中发现,二甲基乙内酰脲(海因)类化合物中,二氯海因、二溴海因、溴氯海因均有良好的消毒作用,它们均属于高效、广谱、实际无毒级的消毒剂。综合评价,以二溴海因为最好,实用性最强。这是因为二溴海因具有如下优点:
1)杀菌谱广,对各种微生物均有杀灭作用,包括细菌芽胞、细菌繁殖体、真菌、病毒、藻类和某些寄生虫,属于高效消毒剂;
3)稳定性好,对消毒粉和消毒片,用加速试验法测定其稳定性,在54℃下放置14d(相当于自然存放一年),有效含量下降很少,自然存放二年,有效含量变化在允许范围之内;消毒液的稳定性也较好;
4)影响消毒效果的因素小,例如,一般含卤消毒剂在高pH下会迅速分解,失去杀菌作用,但pH对二溴海因影响不大;
5)消毒后无残留毒物。二溴海因在消毒过程中释放出有杀菌作用的有效溴,剩余二甲基乙内酰脲分解成氨气和二氧化碳气体,对环境基本无污染;
6)二溴海因不产生难闻的刺激性气味,使用浓度对大多数消毒物品基本无损害;
7)价格便宜,按有效含量和使用浓度计算,价格较低;
8)固体消毒剂和用二溴海因配制的消毒液稳定性均较好。
9)二溴海因消毒剂的主要缺点是溶解性较差,早期的产品还存在保存过程中易变黄问题。近年来的研究已经基本克服了上述不足。
    2 对微生物的杀灭作用
    2.1用定量悬浮试验测定的结果
陈荣凤等(2000)参照英国Russell博士的设计原理和薛广波教授在《灭菌消毒防腐保藏》中具体化的定量悬浮试验方法,测定了二溴海因对几种微生物的杀灭作用。
    2.1.1对金黄色葡萄球菌的杀灭作用见表1。
1  不同浓度二溴二甲基乙内酰脲对金黄色葡萄球菌ATCC 6538的杀灭效果
从表中可见2.5mg/L作用10min,可达到消毒要求,3mg/L作用5min也可达到同样消毒效果。在2.5mg/L二溴海因消毒剂的作用下,金黄色葡萄球菌的存活曲线为:y=26.5779-1.7993 lnx,(R2=0.8514,P<0.01)。这种s型的对数存活曲线符合一般高效消毒剂的杀菌规律。各浓度不同作用时间的杀灭率之间具有显著性差别(P<0.01)。
宁培勇等(2011)报道,用含500mg/L有效溴的二溴海因消毒液,作用15min,对载体上的金黄色葡萄球菌杀灭对数值3.71,作用30min杀灭对数值4.92。李长青(2005)报道,用有效溴200mg/L作用5min,对金黄色葡萄球菌的杀灭对数值为3.32;用300mg/L,作用1min,杀灭对数值为3.17。
   2.1.2对大肠杆菌8099株的杀灭作用
用定量悬浮试验测定的,二溴海因对大肠杆菌杀结果见表2。
表2 不同浓度二溴二甲基乙内酰脲对大肠杆菌8099株的杀灭效果
从表中可以看出,用1mg/L二溴海因消毒剂,作用10min,2mg/L作用5min,可杀灭大肠杆菌99.9%~99.99%。对在二溴海因的作用下,大肠杆菌的死亡规律的数学模拟显示,其存活菌数对数值和作用时间之间呈s型关系,可用下式表达:y=97.433-6.7819 lnx (R2=0.9355, P<0.01)。各浓度不同作用时间的杀灭率之间,具有显著性差别(P<0.01)。
李长青(2005)报道,用有效溴200mg/L,作用5min,对大肠杆菌的杀灭对数值为3.15;300mg/L,作用1min,杀灭对数值为3.09。
   2.1.3对枯草杆菌黑色变种ATCC9372株芽胞的杀灭作用见表3。
表3  不同浓度二溴二甲基乙内酰脲对枯草杆菌黑色变种ATCC 9372株芽胞的杀灭效果
表中显示,用二溴海因1000mg/L作用60min,2000mg/L作用15min,对芽胞的杀灭率达99.9%以上。用在1000mg/L二溴海因消毒剂作用下,不同时间枯草杆菌黑色变种芽胞的存活菌数之间的关系进行数学模拟,结果发现,两者之间呈对数线性关系:y=97.433-6.7810 lnx(R2=0.9355,P<0.01)。这表明,二溴海因对枯草杆菌黑色变种芽胞具有较强的快速杀灭作用。这一结论也被其他研究者的试验所佐证。上海市疾病预防控制中心用同样品牌的二溴海因消毒剂进行的杀芽胞试验显示,用1000mg/L,作用60min,用2000mg/L作用15min,对枯草杆菌黑色变种芽胞的杀灭率均达到99.9%以上,用其他品牌的二溴海因消毒剂,也获得了类似的结果。另据吕瑞芳等(2011)报道,用含有效溴2000mg/L的二溴海因消毒剂作用20min,对枯草杆菌黑色变种芽胞ATCC9372株杀灭对数值为3.16,作用60min,杀灭对数值3.89。
   2.1.4对白色念珠菌的杀灭作用
吕瑞芳等(2011)报道,用有效溴300mg/L的二溴海因消毒剂,对悬液中的白色念珠菌杀作用1min,灭对数值3.93,作用3min,杀灭对数值4.08。李长青(2005)报道,用有效溴350mg/L,作用5min,对白色念珠菌的杀灭对数值为3.29。
   2.1.5对绿脓杆菌的杀灭作用
宁培勇等(2011)用悬液杀菌试验研究了二溴海因消毒剂对绿脓杆菌的杀灭作用,发现用有效溴500mg/L,作用15min,杀灭对数值为3.78,作用30min,杀灭对数值为4.91。可见二溴海因对绿脓杆菌有良好的杀灭作用。
   2.1.6对嗜肺军团杆菌的杀灭作用
陈月英等(2009)研究了二溴海因对军团杆菌的杀灭作用,发现用有效溴200mg/L,作用10min,可完全杀灭悬液中的军团杆菌。
    2.2 用载体定量试验获得的结果
将菌液滴染于载体,待干后,放入消毒液内,作用一定时间后,取出放试管内或有玻璃珠的三角烧瓶内,中和振荡洗菌,用稀释或原液接种平皿,培养,计数菌落。和对照组比较,计算出杀灭率。
 
表4 对枯草杆菌黑色变种芽胞的杀灭作用 
有效溴含量
(mg/L)
作用不同时间(min)的平均杀灭率及范围(%)
15
30
45
60
2000
 
1000
 
500
99.90
(99.90-99.91)
99.10
(99.02-99.17)
98.20
(98.17-98.24)
99.95
(99.94-99.96)
99.70
(99.64-99.78)
98.97
(98.92-99.02)
99.98
(99.98-99.99)
99.87
(99.87-99.88)
99.79
(99.76-99.81)
100
 
99.95
(99.94-99.96)
99.87
(99.86-99.88)
注:阳性对照组平均菌数及范围为7.50×105cfu/片(7.10×105cfu/片~7.90×105cfu/片)
        阴性对照组:中和剂、PBS、培养基无细菌生长。
 
从表中可以看出,用二溴海因2000mg/L作用15min,1000mg/L作用60min,对芽胞的杀灭率均可达99.9%以上。
李长青(2005)报道,用有效溴1000mg/L,作用30min,对枯草杆菌黑色变种芽胞ATCC9372株的杀灭对数值为3.17,作用40min,杀灭对数值为3.93。可见二溴海因对细菌芽胞有很强的杀灭作用。
至于有个别报道二溴海因对细菌芽胞的杀灭结果不太理想,这可能是他们所用的二溴海因消毒剂质量不好,或配方不合理,也可能在试验方法或试验菌株等方面存在问题。
2.2.2二溴海因消毒剂对金黄色葡萄球菌的杀灭作用见表5。
表5 对金黄色葡萄球菌的杀灭作用
有效溴含量
(mg/L)
作用不同时间(min)的平均杀灭率(%)及其范围
2
5
10
20
200
 
100
 
50
100
 
99.98
(99.98-99.99)
97.50
(97.05-97.78)
100
 
100
 
98.78
(98.54-99.07)
100
 
100
 
99.08
(99.03-99.14)
100
 
100
 
99.93
(99.93-99.94)
注:阳性对照组平均菌数及范围为9.50×105cfu/片(9.20×105cfu/片~9.80×105cfu/片)
    阴性对照组:中和剂、PBS、培养基无细菌生长。
 
表中显示,对金葡菌用100mg/L作用2min,杀灭率可达99.98%以上,用200mg/L作用2min,杀灭率可达100%。
2.2.3对大肠杆菌的杀灭效果
表6给出了二溴海因消毒剂对大肠杆菌的杀灭试验结果。显示用100mg/L作用2min,对大肠杆菌杀灭率可达99.99%以上,用200mg/L作用2min,杀灭率可达100%。可见二溴海因对大肠杆菌有强大的杀灭作用。
表6 对大肠杆菌的杀灭作用
有效溴含量
(mg/L)
作用不同时间(min)的平均杀灭率及范围(%)
2
5
10
20
200
 
100
 
50
100
 
99.99
(99.99-100)
99.02
(98.85-99.16)
100
 
100
 
99.59
(99.49-99.67)
100
 
100
 
99.94
(99.91-99.95)
100
 
100
 
99.99
(99.99-99.99)
注:阳性对照组平均菌数及范围为5.50×105cfu/片(5.20×105cfu/片~5.80×105cfu/片)
    阴性对照组:中和剂、PBS、培养基无细菌生长。
 
宁培勇等(2011)报道,用含500mg/L有效溴的二溴海因消毒液杀灭载体上的大肠杆菌,作用15min,杀灭对数值3.81,作用30min,杀灭对数值4.95。
2.2.4对白色念珠菌的杀灭效果
  表7是载体杀灭试验的结果。显示用200mg/L作用2min,对白色念珠菌的杀灭率达到了99.99%。作用5min可全部杀灭。
表7 对白色念珠菌的杀灭作用
有效溴含量
(mg/L)
作用不同时间(min)的平均杀灭率及范围(%)
2
5
10
20
300
 
200
 
100
 
99.99
(99.99-100)
99.99
(99.99-100)
99.57
(99.53-99.60)
100
 
100
 
99.72
(99.68-99.75)
100
 
100
 
99.99
(99.99-100)
100
 
100
 
100
注:阳性对照组平均菌数及范围为8.20×105cfu/片(7.90×105cfu/片~8.50×105cfu/片)
    阴性对照组:中和剂、PBS、培养基无细菌生长。
 
2.2.5二溴海因对病毒的杀灭作用
2.2.5.1 对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的破坏作用
 乙型肝炎表面抗原破坏试验结果见表8。
表8 对HBsAg抗原性破坏试验结果
有效溴含量
(mg/L)
作用不同时间(min)的平均滴度及范围
2
5
10
20
2000
 
1000
 
500
 
3.90
(3.71-4.03)
5.64
(5.46-5.86)
30.14
(29.94-30.31)
3.40
(3.28-3.49)
4.21
(4.09-4.31)
24.95
(24.71-25.14)
2.29
(2.14-2.43)
2.75
(2.60-2.89)
18.15
(17.49-18.86)
1.77
(1.69-1.86)
2.34
(2.14-2.51)
12.06
(11.94-12.29)
 
从表中可以看出,用二溴海因消毒剂对HBsAg有明显破坏作用,用有效溴2000mg/L,作用20min,平均滴度为1.77(<2.1)。需要指出的是,HBsAg是乙型肝炎的外壳而不是病毒本身,这种糖蛋白外壳比作为亲脂病毒的乙型肝炎病毒(HBV)对消毒剂的抵抗力大的多。
2.2.5.2 对脊髓灰质炎病毒的杀灭作用
冷红英等(2012)用定量悬液灭活试验研究了二溴海因消毒剂对脊髓灰质炎病毒的杀灭作用,结果发现,用含1000mg/l有效溴的消毒液作用15min,对含30g/l牛血清白蛋白悬液中的脊髓灰质炎病毒灭活对数值﹥4.00; 含3g/l牛血清白蛋白悬液中的脊髓灰质炎病毒,用含有效溴250mg/l的二溴海因消毒液作用5min杀灭对数值﹥4.00。脊髓灰质炎病毒是一种亲水病毒,对消毒剂的抵抗力较强,能杀灭脊髓灰质炎病毒指示对其它病毒也有良好杀灭作用。
2.3 现场试验结果
上海市疾病预防控制中心按照卫生部《消毒试验技术规范》的方法进行了现场试验,在台面上选取试验区和对照区,试验区用200mg/L有效溴的二溴海因,擦拭消毒,作用10min,30个样品,获得的对自然菌平均杀灭率为98.20%(我国规定,自然菌杀灭率≥90%为消毒合格)。可见二溴海因消毒剂对表面上污染的各种自然菌也有强大的杀灭作用。
3 二溴海因杀灭微生物的机制
我们对二溴海因消毒剂杀灭微生物的机制进行了研究,发现二溴海因杀灭微生物是个复杂的过程。其作用靶也具有多元性。它不仅可以作用于微生物的外层结构,也可以作用于微生物内部的蛋白质和核酸,导致微生物结构蛋白的溶解和功能蛋白的失活,从而将微生物杀灭。
3.1二溴海因对细菌细胞作用的投射电镜观察
用有效溴1000mg/L的二溴海因消毒液,作用5min,导致枯草杆菌黑色变种芽胞核心和外壳肿胀,作用15min芽胞外壳层消失:作用30min芽胞内容物破坏;作用60min,芽胞变为空泡。图1~图5。

图1:正常枯草杆菌黑色变种芽胞层次结构清晰,核区电子密度高,边缘整齐。
图2:有效溴1000mg/L,作用5min后的芽胞核心和外壳肿胀,但均完整。
图3:有效溴1000mg/L,用15min后,芽胞外壳层次消失。
图4:有效溴1000mg/L,作用30min后,芽胞核心出现透电子区。
图5:有效溴1000mg/L,作用60min后,芽胞外壳僵化,核心出现大范围的透电子区。
 
3.2 二溴海因对微生物细胞结构和蛋白质的作用
时间(min)
不同浓度作用后枯草杆菌芽胞蛋白质漏出量(μg/ml)
1000(mg/L)
2000(mg/L)
4000(mg/L)
0
5
15
30
60
90
0.11
17.56
57.09
34.31
33.87
26.67
0.11
20.65
66.94
49.49
41.95
19.03
0.11
40.19
74.28
59.74
30.35
21.23
3.3 二溴海因对微生物核酸的作用
用1000mg/L、2000mg/L和4000mg/L二溴海因作用于枯草杆菌黑色变种芽胞,自第5min即可测出DNA漏出(4.85μg/ml~38.25μg/ml),随作用时间延长DNA漏出量增多,至90min时,漏出量达21.10μg/ml~78.75μg/ml。说明了消毒剂破坏了微生物的外层结果,使其通透性增加,导致DNA的漏出。见表10
 
表10 二溴海因作用不同时间后DNA的漏出量
时间(min)
不同浓度作用后DNA的漏出量(μg/ml)
1000(mg/L)
2000(mg/L)
4000(mg/L)
5
15
30
60
90
4.85
12.15
14.55
17.95
21.10
22.80
31.05
34.90
39.45
45.50
38.25
46.55
54.35
63.60
78.75
 
用电泳法观察了在二溴海因的作用下细菌DNA的变化,结果发现DNA破坏,双链断裂,出现杂乱的电泳带。说明DNA的分子被破坏。见图6。

4 影响二溴海因消毒效果的因素
4.1 温度的影响  
卤化甲基海因的杀菌作用会受到温度的影响,温度升高所需的杀灭时间缩短。林立辉等报道,含有效氯300mg/L的二氯海因溶液,15~25℃下杀灭枯草黑色变种芽胞达到99.999%需20min,35℃时需15min。但温度对二溴海因杀菌效果的影响不大,在试验温度10℃~30范围内,降低温度对二溴海因的杀军团杆菌作用仅有轻度影响。
4.2.pH值的影响 
二氯海因在偏酸性的环境中杀菌效果较强,在偏酸性(pH范围最佳为5.8~7.0)的环境中更容易释放出次氯酸,但若pH大于9时会迅速分解。而二溴海因的杀菌作用能适用于pH值变化更大的环境中,即使在含有NH3和H2S的环境中,也能发挥很好的杀菌作用。陈月英等(2009)报道,在pH 5~9范围内,对二溴海因杀灭军团杆菌的效果基本无影响。
4.3 有机物 
有机物对二氯海因和溴氯海因消毒剂的杀菌效果有明显的影响,但对二溴海因消毒效果的影响较小。陈越英等(2009)报道,在试验菌悬液内加入50%小牛血清,对二溴海因杀灭军团杆菌的效果基本没有影响。
5 二溴海因消毒剂的稳定性
5.1固体剂型
5.1.1加速试验结果
二溴海因消毒粉和消毒片,在54℃温箱,放置14d(相当自然存放一年),有效溴含量下降6.15%(片)和8.%(粉)。
5.1.2纯二溴海因粉
在54℃温箱,放置14d,有效溴含量下降0.15%。
5.2 二溴海因消毒液的稳定性
我们观察到,将二溴海因消毒片或消毒粉配成使用液,开始时有效溴含量为1012mg/L,在室温下放置(13℃~18℃)至第7d,为lOlOmg/L,下降率为O.19%,至第15d,下降率为5.2%。
6 毒性和对物品的损害
上海市疾病预防控制中心按照卫生部《消毒技术规范》的方法对二溴海因的毒理进行了研究,结果发现:经口急性毒性属实际无毒级,小鼠LD50>5.Og/kg;蓄积毒性试验,属弱蓄积毒性;无遗传毒性(无致微核作用);皮肤粘膜刺激试验,阴性,对皮肤粘膜无刺激作用;金属腐蚀性试验,用有效溴2000mg/L进行试验,发现对不锈钢基本无腐蚀,对碳钢、铜片和铝片有轻度腐蚀。
张月明等(2007)研究了二溴海因的亚急性毒性,结论为:二溴海因消毒剂对大鼠亚急性毒性试验各项指标均在正常范围内。染毒最高剂量为1000mg/kg(体重),各试验组动物在染毒期内未见明显中毒表现。生长活动基本正常,无动物死亡,血液和生化指标均在正常范围内。大体解剖未见异常。各器官未见病理改变和特异性损伤。
7 二溴海因在消毒上的应用
7.1 医院消毒中的应用
7.1.1用于医院环境消毒
各种表面的消毒:如桌面、地面等,有效溴500mg/L,作用10min~30min。
7.1.2诊疗用品消毒
卫生洁具、診疗用品(体温表、导管、注射器等),用浸泡法消毒,500mg/L~1000mg,30min。/L
7.1.3特殊污染物品消毒
艾滋病病毒、肝炎病毒、结核杆菌、炭疽杆菌等污染物,用有效溴1000mg/L,作用30min~60min。
7.2 水和贮水容器的消毒
7.2.1贮水容器消毒
大小瓶装水和饮料的瓶子,用含有效溴500mg/L的二溴海因冲洗消毒,作用15min~30min。高层水箱的消毒:用500mg/L二溴海因冲洗后,用二溴海因缓释块消毒,维持1mg/L~5mg/L,每块用60d左右。
7.2.2游泳池水消毒
加入量10 mg/L~20mg/L,保持水中有效溴1mg/L:
7.2.3污水处理
按500mg/L的浓度加入,作用1h;
7.3 水产消毒
各类鱼塘、对虾、河蚌……:10mg/L~20mg/L,作用60min。
7.4 畜牧消毒
各类饲养场的环境消毒:用含有效溴200mg/L~500mg/L的二溴海因冲洗环境,喷洒窝棚,消毒用水和食槽;
7.5 食品水果保鲜
用100mg/L~200mg/L浓度喷洒或浸泡后凉干密闭保存。
7.6 家庭消毒中的应用
7.6.1各种表面消毒
采用擦拭法,用500mg/L有效溴的二溴海因消毒液,作用10min~20min。
7.6.2物品消毒
餐具、用具、玩具、卫生洁具等,用浸泡法,有效溴500mg/L,浸泡20min~30min。
参考文献略
陈荣凤(上海市健康职业技术学院)

 

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